BX63 — флагманская моторизованная платформа прямого микроскопа для исследований, где критичны воспроизводимость и разрешение. Полная моторизация осей, смены фильтров и тубусов, а также интеграция с камерами sCMOS/EMCCD превращают его в «станок» для многоканальной флуоресценции, Z-сканирования и тайм-лапсов. Главная идея: не только «видеть» слабые сигналы, но и измерять их количественно, избегая артефактов.
Высокое разрешение здесь — это не только максимальная числовая апертура объектива, но и дисциплина эксперимента: корректная оптика, выверенное освещение, грамотные фильтры и бережная работа с образцом. Ниже — практические шаги, помогающие получать чистые, детальные изображения, готовые к количественному анализу.
Перечень доступных флуоресцентных кубов и фильтров
Подбор фильтров — фундамент точного эксперимента. Для BX63 доступны как широкополосные «универсальные» кубы, так и узкополосные наборы под конкретные флуорофоры и задачи (иммунометки, FRET, спектральная развязка). Типичные каналы:
- DAPI/HOECHST (синий канал)
Возбуждение ~350–405 нм, эмиссия ~430–480 нм. Узкополосные наборы уменьшают фон автофлуоресценции и засвет покровного стекла. - FITC/Alexa 488/GFP (зелёный канал)
Ex ~470–490 нм, Em ~510–550 нм. Часто применяют «clean-up» возбуждающий фильтр для срезания «хвостов» спектра. - TRITC/Cy3/mCherry (оранжево-красный канал)
Ex ~540–560 нм, Em ~570–620 нм. Хорош для иммунометок средней яркости; важно следить за перекрытиями с FITC при колокализации. - Cy5/Alexa 647 (далёкий красный)
Ex ~620–650 нм, Em ~660–720 нм. Низкий тканевой фон, но падение квантовой эффективности камеры — потребуются более длинные экспозиции. - CFP/YFP (FRET-пара)
Специализированные FRET-кубы с разделением донор/акцептор и каналом донор-возбуждение/акцептор-эмиссия для измерения эффективности переноса. - Сет-наборы для колокализации
Узкополосные «matched» пары (например, FITC/TRITC с минимальным перетоком) — для точных расчётов коэффициентов Мандерса/Пирсона. - Наборы для автофлуоресценции растений и тканей
Широкие «red-shifted» эмиссионные окна для хлорофилла/лигнина; полезно при исследованиях срезов растений.
Практические подсказки:
- Подбирайте узкополосные фильтры, если важна селективность и колокализация; широкие — когда критична чувствительность и скорость.
- Сверяйте спектры меток с паспортами фильтров: максимум возбуждения/эмиссии должен попадать в окна; избегайте «кросс-толка» соседних каналов.
- Для слабых меток используйте высокопропускающие дихроики и «long-pass» эмиссионные фильтры — так вы выжмете больше фотонов.
Описание методов настройки интенсивности света и защиты образцов от фотовыцветания
Высокое разрешение бессмысленно, если образец выгорает или «шумит». Стратегия — собрать как можно больше полезных фотонов в единицу времени, не убивая метки.
- Кёлеровская установка в светлом поле перед флуоресценцией
Настройте полевую и апертурную диафрагмы, сцентрируйте конденсор, добейтесь равномерного поля. Это снижает паразитный фон и делает фокусировку точнее. - Источник света
- Современные LED-осветители дают стабильный спектр, быстрый электронный шторочный режим и меньший нагрев по сравнению с металлогалогенными лампами.
- Регулируйте мощность аппаратно (контроллер света) и временным методом (минимизируйте длительность включения).
- Экспозиция и камера
- Цель — заполнить 60–80 % динамического диапазона гистограммы без клиппинга.
- Для слабых сигналов увеличивайте экспозицию, а не мощность света; используйте биннинг 2×2/4×4, если задача — повысить SNR, а не пространственную тонкость.
- Подбирайте масштаб C-mount так, чтобы эффективный пиксель на образце соответствовал критерию Найквиста: ~λ/(2·NA) для флуоресценции (часто 100–160 нм/пикс на образце для NA 1.3–1.4 в зелёном канале; для водных объективов NA 1.0 — крупнее).
- Защита от фотовыцветания и фототоксичности
- Снимайте каналы последовательно от коротких к длинным волнам (DAPI → FITC → TRITC → Cy5).
- Между кадрами держите затвор закрытым; включайте свет только на время экспозиции (аппаратная синхронизация камера↔LED).
- Используйте антифейд-среды (гашение кислорода, радикалов), минимальную толщину монтажной среды и чистые покровные стёкла №1.5H.
- Уменьшайте повторные проходы: вместо многократной «подкрутки» экспозиции сделайте быстрый брекетинг (короткая/номинальная/длинная) и выберите оптимум в ПО.
Дополнительно: стабилизируйте температуру образца и микроскопа перед сериями (10–20 минут), чтобы уменьшить дрейф фокуса.
Особенности моторизованной смены фильтров и автоматического фокусирования
BX63 изначально проектировался как «оркестр» моторизованных узлов: фильтр-кубы, колёса возбуждающих/эмиссионных фильтров, тубусы, оси XY и Z, шторки и источники света — всё синхронизируется программно.
- Моторизованная смена фильтров
- Туррет/колёса переключают каналы за доли секунды, что критично для многоканальных тайм-лапсов и FRET.
- Последовательная съёмка «канал-за-каналом» минимизирует перекрёстную засветку и дрейф; ПО управляет порядком, задержками и экспозициями.
- Автофокус
- Контрастный (по изображению) — универсален, но требует достаточной текстуры в поле; идеально для срезов и тканей.
- Лазерный/рефлектометрический (если установлен) — быстрее и устойчивее к изменению яркости, хорош для длинных серий.
- Рекомендация: задайте «безопасные пределы» хода Z и референс-плоскость; включайте микро-подстройку перед каждым каналом для компенсации хроматического смещения.
- Сценарии автоматизации
- Макросы для: последовательностей каналов, Z-стеков, тайм-лапсов, мозаик (stitching), многообразцовых планшетов.
- Журналирование метаданных (экспозиции, усиления, позиции, температура) — основа воспроизводимости.
Если вы на этапе выбора конфигурации, приобрести BX63 с нужным набором фильтров, моторизованных узлов и камер, а также получить стартовую настройку и обучение, можно в компании Микроптика — специалисты помогут согласовать спектры меток, апертуры объективов и параметры съёмки под ваши протоколы.
Практические примеры применения в иммунофлуоресценции и живой клеточной съемке
Иммунофлуоресценция (фиксированные клетки/ткани, 3–4 канала)
- Подготовка и оптика
- Объективы план-апохроматы 40×/0.95 dry или 60×/1.25 oil для максимального разрешения; покровное стекло №1.5H, иммерсионное масло с указанной n.
- Проверка плоскостности среза, очистка стекол, маркировка ориентации.
- Съёмка
- Порядок каналов: DAPI → Alexa 488 → Cy3 → Cy5.
- Единая область интереса (ROI), автофокус перед каждым каналом, экспозиция под 70–80 % пика гистограммы.
- При колокализации — узкополосные фильтры, одинаковый масштаб и параметры камеры; компенсируйте переток (bleed-through) через контрольные пробы одноцветных меток.
- Последующая обработка
- Деконволюция с PSF под конкретный объектив/λ (умеренно), затем расчёт коэффициентов Мандерса/Пирсона.
- Нормализация по экспозиции и усилению; хранение метаданных вместе с файлами.
Живая клеточная съёмка (срезы мозга, зародыши рыб/насекомых, растительные ткани)
- Среда и стабильность
- Камера перфузии на столике, поддержание температуры, газовой смеси (если требуется). Для воды — объективы 40×–60×/0.8–1.0 W с длинным рабочим расстоянием.
- Минимальный свет, короткие экспозиции; аппаратная синхронизация LED↔камера, закрытый затвор вне экспозиции.
- Каналы и режимы
- Кальциевая динамика: зелёные индикаторы (GCaMP) — высокий FPS, ROI-кроп; красные индикаторы — длиннее экспозиция, аккуратнее с фототоксичностью.
- Двухканальные тайм-лапсы: чередование каналов по циклу, автофокус каждые N кадров, контроль дрейфа по контрольной метке.
- Z-стеки для 3D: шаг 0,3–0,5 мкм под критерий Найквиста по Z, быстрая пьезо-ось при необходимости.
- Минимизация повреждений
- Антиоксидантные буферы, низкое содержание красителей, отбор наиболее ярких полей для сокращения числа состояний «свет включён».
- Если сигнал слаб — лучше увеличить чувствительность (биннинг/усиление) и чуть снизить частоту кадров, чем «палить» мощностью.
